微量法

正式測定前務(wù)必取2-3個預(yù)期差異較大的樣本做預(yù)測定
測定意義：
PPO（EC1.10.3.1）主要存在于動物、植物、微生物和培養(yǎng)細(xì)胞中，是一種含銅的氧化酶， 能使一元酚和二元酚氧化產(chǎn)生醌，從而引起褐化，與果蔬加工、茶葉品質(zhì)和組培等密切相關(guān)。
測定原理：
PPO 能夠催化鄰苯二酚產(chǎn)生醌，后者在 525nm有特征光吸收。
需自備的儀器和用品：
可見分光光度計/酶標(biāo)儀、臺式離心機、水浴鍋、可調(diào)式移液器、微量石英比色皿/96 孔板、研缽、冰和蒸餾水。
試劑組成和配制：
提取液：100mL×1 瓶，4℃保存； 試劑一：20mL×1 瓶，4℃保存； 試劑二：5mL×1 瓶，4℃保存； 試劑三：10mL×1 瓶，4℃保存；
粗酶液提取：
1、細(xì)菌、細(xì)胞或組織樣品的制備：
細(xì)菌或培養(yǎng)細(xì)胞：先收集細(xì)菌或細(xì)胞到離心管內(nèi)，離心后棄上清；按照細(xì)菌或細(xì)胞數(shù)量（104 個）：提取液體積（mL）為500~1000：1的比例（建議500萬細(xì)菌或細(xì)胞加入1mL提取液），超聲波破碎細(xì)菌或細(xì)胞（冰浴，功率 20％或200W，超聲3s，間隔10s，重復(fù)30次）；8000g 4℃ 離心10min，取上清，置冰上待測。
組織：按照組織質(zhì)量（g）：提取液體積(mL)為1：5~10的比例（建議稱取約0.1g組織，加入1mL提取液），進行冰浴勻漿。8000g 4℃離心10min，取上清，置冰上待測。
2、血清（漿）或果汁樣本的處理：
按照血清（漿）或果汁體積（mL）：提取液體積(mL)為1：5~10的比例（建議取0.1mL血清
（漿）或果汁加入1mL提取液），進行冰浴勻漿。8000g 4℃離心10min，取上清，置冰上待測。

測定步驟：
1、分光光度計或酶標(biāo)儀預(yù)熱30min以上，調(diào)節(jié)波長至525nm，蒸餾水調(diào)零。
2、樣本測定（在 EP 管中依次加入下列試劑）

試劑名稱（μL）	測定管	對照管
試劑一	200	200
試劑二	50	50
樣本	50
煮沸的樣本		50

37℃(哺乳動物)或 25℃（其它物種）中準(zhǔn)確水浴10min 后迅速放入冰浴中冷卻

試劑三

100

100

充分混勻，10000g，常溫離心10min，收集上清，取200μL至微量石英比色皿或96孔板中，525nm 處檢測測定管和對照管吸光度，計算 ΔA=A測定-A對照。
注意：每個測定管需要設(shè)一個對照管。可以在不同對照管中加入不同樣品的粗酶液，然后集中進行 1min 沸水浴處理。
PPO 活性計算：
a. 用微量石英比色皿測定的計算公式如下1、血清（漿）或果汁PPO活性
單位的定義：每分鐘每mL血清（漿）或果汁在每mL反應(yīng)體系中使525nm處吸光值變化0.01 為一個酶活力單位。
PPO（U/mL）=ΔA×V 反總÷(V 液× V 樣÷V 樣總)÷0.01÷T =80×ΔA÷V 液
2、組織、細(xì)菌或細(xì)胞 PPO 活性
（1） 按樣本蛋白濃度計算：
單位定義：每分鐘每mg組織蛋白在每mL反應(yīng)體系中使525nm處吸光值變化0.01為一個酶活力單位。
PPO（U/mg prot）=ΔA×V 反總÷（V 樣×Cpr）÷0.01÷T =80×ΔA÷Cpr 此法需要自行測定樣本蛋白質(zhì)濃度。
（2） 按樣本鮮重計算：
單位定義：每分鐘每g組織在每mL反應(yīng)體系中使525nm處吸光值變化0.01為一個酶活力單位。PPO（U/g 鮮重）=ΔA×V 反總÷(W×V 樣÷V 樣總)÷0.01÷T =80×ΔA÷W
（3） 按細(xì)菌或細(xì)胞密度計算：
單位定義：每分鐘每1萬個細(xì)菌或細(xì)胞在每mL反應(yīng)體系中使525nm處吸光值變化0.01為一個酶活力單位。
PPO（U/104cell）=ΔA×V 反總÷(500×V 樣÷V 樣總)÷0.01÷T =0.16×ΔA
V 反總：反應(yīng)體系總體積，0.4mL；V 液：加入血清（漿）或果汁體積，0.1mL；V 樣：加入樣本體積，0.05mL；V 樣總：加入提取液體積，1 mL；T：反應(yīng)時間，10 min；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/mL；W：樣本質(zhì)量，g；500：細(xì)胞或細(xì)菌總數(shù)，500 萬。